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合成生物学論文メモ (Jan 2021)

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27報

Synthetic Biology

Transcription/Translation Control

遺伝子回路、転写翻訳制御など
二種類の人工TF(Gal4-splitABA binding domain/split ABA binding domain-VP16, dCas9-splitGA binding domain/splitGA binding domain-VPR)を段階的に調節する回路により、酵母における内在性の発現ノイズ、及び発現量の分散を調整可能に。
発現量の平均と分散をコントロールする発想があったか。
E.coliのTF誘導型プロモーターの構造(配列、プロモーター-オペレーター間距離、UPエレメント)による発現量変化を解析、TF結合の熱力学的な数理モデルの構築を行い、最適な構造を探索した。
地味だけど良い研究。
C.glutamicusにおいて、プロモーターとbicistronic RBSとの組み合わせで精密な発現量制御を行い、Arg合成経路の最適化を行った。
bcRBSというのを知らなかったけど、割と便利そう。
B.subtilis由来のp-coumaric acid応答性のTF(PadR)を導入したバイオセンサーを作成し、B.subtilisでターゲットプロモーターと遺伝子の間に存在する二つの遺伝子(yveF, yveG: 詳細な機能は未知)の挿入によって制御時の発現量が増加する事を示した。また、結晶構造を元に選んだTF-DNA結合に関わる残基を置換する事で更に応答性能を向上させた。
遺伝子論理回路のデザインにおいて、プラスミドバックボーンとホスト細胞種の組み合わせが回路の性能に関わる事を示し、これらを考慮に入れる事で最大12段階の論理ゲートを実装可能に。
結構な違いが出ていて驚き。
クロマチン制御因子(HP1, DNMT1)を標的とするナノボディをTetRと組み合わせることで、エピジェネティックな遺伝子発現制御システムを構築。DNMT1では約6割の細胞で制御誘導後の形質が記憶された他、標的以外のクロマチン制御因子(DNMT3A, KRAB)を組み合わせる事でDNMT1による発現制御速度および形質の記憶効率が向上した。
エピジェネティック工学も回路が組めるようになってきた。

RNA Synthetic Biology

アプタマー、リボザイムなど
E.coliにおいて、他の細菌のrRNAを発現させて直行性の高い翻訳系を構築。E.coliと進化的に近い細菌のrRNAほど翻訳効率が高く、非翻訳領域ほど配列保存性が低かった事から、rRNAのプロセシング効率を向上させるために非翻訳領域をE.coliに置き換えると翻訳効率が向上した。

Cell-free / Reconstruction

無細胞系、再構成など
無細胞発現系のPUREを用いて、Tu因子を除く全ての翻訳因子と20種類のアミノアシルtRNA合成酵素を単一のプラスミドから発現させた。
自作のPUREだとやはりバイアスが結構かかってしまうらしい。
BrvGを取り込むaaTSを無細胞系で発現させ、翻訳後の化学修飾によってアゾールを含むアミノ酸配列を高効率に生産することに成功。
Leu-tRNA合成酵素の変異体スクリーニングによってSM60(UV刺激でcitrullinationを起こすアミノ酸類自体)と結合し、尚且つアンバーコドンと対合するようなLeu-tRNAを合成する変異体を作成。これを用いてタンパク質に残基特異的にSM60を導入し、部位特異的citrullinationを可能にした。
Citrullination自体も初めて知ったけど、aaRSの変異で部位特異的に翻訳後修飾を入れられるって凄いな。

Optogenetics

光駆動型ツール、蛍光イメージング、光受容体など、その他〇〇genetics系
タンデム化したtetOのDNAスポンジと相分離ドロップレットを形成するFUS(orDDX4, hnRNPA1)をTetR-VP16に繋げたものを使い、相分離による転写活性の向上を実現。更に、CRY2-CIBNシステムによって青色光誘導型の相分離ドロップレット形成&転写活性化システムを構築。
相分離による転写活性化で、青色光なのに生体マウスの組織深部での転写発現制御が出来ていて強力。相分離の合成生物学はこれから色々出て来そう。
  • Rational Design of a Split Flavin-Based Fluorescent Reporter
  • Authors: Yudenko, Anna; Smolentseva, Anastasia; Maslov, Ivan; Semenov, Oleg; Goncharov, Ivan M; Nazarenko, Vera V; Maliar, Nina L; Borshchevskiy, Valentin; Gordeliy, Valentin; Remeeva, Alina; Gushchin, Ivan
  • Journal: ACS Synthetic Biology
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1021/acssynbio.0c00454
  • Institution: Moscow Institute of Physics and Technology, Russia
種々のLOVドメインのアラインメントから、進化的保存度の低いループ領域を検出し、検出部位でLOVドメインを分割したsplit蛍光タンパクを作成。
理論的なタンパク質デザインをしていて、非常に良い論文。
青色光誘導型リプレッサー(EL222)の発現抑制でdCpf1と代謝関連クラスターの発現抑制を行い、dCpf1によって代謝経路上流の酵素の発現を抑制する事で、下流の物質の産生量を増加させた。
Fig3は青色光照射無しとの比較がないとコントロールが取れていない気がする。
青色発光タンパク(Nluc)と青色光誘導性のTF(GAVPO: Gal4-VVD-p65)を繋ぎ、BRETによる遺伝子発現誘導を実装。他の小分子誘導型のTFに比べて応答性が高く、マウスにおけるインスリン産生をパルス状に誘導出来た。
何故わざわざBRETなのかと思ったら、意外な性能だった。

Protein Engineering

タンパク質工学
  • Bottom-up de novo design of functional proteins with complex structural features
  • Authors: Yang, Che and Sesterhenn, Fabian and Bonet, Jaume and van Aalen, Eva A and Scheller, Leo and Abriata, Luciano A and Cramer, Johannes T and Wen, Xiaolin and Rosset, St{\'e}phane and Georgeon, Sandrine and Jardetzky, Theodore and Krey, Thomas and Fussenegger, Martin and Merkx, Maarten and Correia, Bruno E
  • Journal: Nature Chemical Biology
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1038/s41589-020-00699-x. (École Polytechnique Fédérale de Lausann
  • Institution: École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Switzerland
タンパク質結合モチーフの周囲に二次構造の組み合わせをデザインし、物理化学的性質及び構造を評価。作成した結合タンパクを使用してBRETセンサー、シグナル受容体タンパクを実装。
タンパク質デザインあるある: こんな簡単に出来たら苦労しない。
プロテアーゼのデザイン&選別を行う手法(YESS: 細胞表面への標的基質の露出、露出したタンパクへのエピトープタグ、FACSの組み合わせ)の改良版(基質を変えるクローニングを簡単にした&プロテアーゼの発現量を調節可能にした)を用いて、TEVプロテアーゼの活性を向上させる事に成功。
  • Direct control of CAR T cells through small molecule-regulated antibodies
  • Authors: Park, Spencer; Pascua, Edward; Lindquist, Kevin C; Kimberlin, Christopher; Deng, Xiaodi; Mak, Yvonne S L; Melton, Zea; Johnson, Theodore O; Lin, Regina; Boldajipour, Bijan; Abraham, Robert T; Pons, Jaume; Sasu, Barbra Johnson; Van Blarcom, Thomas J; Chaparro-Riggers, Javier
  • Journal: Nature Communications
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1038/s41467-020-20671-6
  • Institution: Pfizer, USA
抗原認識部位のランダムな組み合わせライブラリから、薬剤(MTX: methotrexate)と標的(CD33, EGFR)の両方に特異性を持つ抗体を設計。薬剤投与によってCAR T細胞の活性を制御可能に。

CRISPR/Cas

クリスパー系
SpyCas9のPAM配列の嗜好性について、抑制と活性の両方で選別をかけるようなdirected evolutionによる制御性能の向上を行った。進化後のライブラリを解析すると嗜好性が拡張している事が明らかとなった。

Metabolic/Signal Pathway Engineering

シグナル経路、代謝経路、酵素工学など
  • A new-to-nature carboxylation module to improve natural and synthetic CO 2 fixation
  • Authors: Scheffen, Marieke and Marchal, Daniel G and Beneyton, Thomas and Schuller, Sandra K and Klose, Melanie and Diehl, Christoph and Lehmann, Jessica and Pfister, Pascal and Carrillo, Martina and He, Hai and Aslan, Selcuk and Cortina, Nina S and Claus, Peter and Bollschweiler, Daniel and Baret, Jean-Christophe and Schuller, Jan M and Zarzycki, Jan and Bar-Even, Arren and Erb, Tobias J
  • Journal: Nature Catalysis
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1038/s41929-020-00557-y
  • Institution: Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Germany
炭素同化経路として提案されたTaCO経路において必須となる酵素glycolyl-CoA carboxylaseを作成し、vitroで再構成した系で炭素固定能を実証。
酵素活性部位の予測から炭素固定能の計算まで行っていて良い。
K. rhaeticusによるセルロース産生の基質であるグルコース/フルクトースの環境中濃度を、共生する酵母(S. cerevisiae)の遺伝子回路で制御されるinvertase(スクロースを加水分解)分泌とスクロース濃度で制御可能に。また、invertaseの発現をTFの制御下に置く事で薬剤(estradiol誘導型TF)や光(CRY2-CIBN)によるセルロース繊維の産生誘導も可能。
共生系の経路の開発は生育/誘導条件の最適化が中々難しそうだが、数理的なデザインはどの程度出来るのかな。

DNA / Biophysics

DNA、核酸論理回路、ナノスケール構造物など
電気刺激で誘導されるプラスミドコピー数の変化によってCRISPR配列の種類とリピート数をコントロールする方法で、情報を生きたE.coliゲノムに書き込む方法を提案。

Alternative Hosts / Strain Engineering

宿主や系統株の開発
dCas9と人工TF(VPR)を使った転写制御機構を(filamentous fungi)で実装。これを使って、WTでは転写が起こらない(macrophorin)の遺伝子クラスターを発現させた。
コロニー形成をし辛く細菌密度が低いために、古典的な遺伝子工学が難しい鉄酸化細菌であるM. ferrooxydansにおいて、E. coliとの共生を介した形質転換を可能にした。

Viral Engineering

ファージ関連
既存のP2ファージの産生手法においてヘルパーファージのコンタミが生じてしまう問題を、P4ファージの発現制御因子(δ, ε遺伝子)を導入してP2ファージ自身がヘルパーとして働けるように改良して解決。
  • Characterizing the portability of phage-encoded homologous recombination proteins
  • Authors: Filsinger, Gabriel T; Wannier, Timothy M; Pedersen, Felix B; Lutz, Isaac D; Zhang, Julie; Stork, Devon A; Debnath, Anik; Gozzi, Kevin; Kuchwara, Helene; Volf, Verena; Wang, Stan; Rios, Xavier; Gregg, Christopher J; Lajoie, Marc J; Shipman, Seth L; Aach, John; Laub, Michael T; Church, George M
  • Journal: Nature Chemical Biology
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1038/s41589-020-00710-5
  • Institution: Harvard University, USA
ファージ由来のSSAP(single-stranded DNA annealing protein)によるゲノム編集能がホストの生物種によって大きく異なる原因が、ホスト細胞側のSSB(single-stranded DNA binding protein)とSSAPとの特異的な相互作用にある事を突き止め、相互作用をするSSBを同時に発現させる事で異なる細菌種でも組み換え効率を向上させた。
古典的なバイオっぽい解析と合成生物学的な応用が両方あって良い。
  • aeruginosa synthetic phages with reduced genomes
  • Authors: Pires, Diana P; Monteiro, Rodrigo; Mil-Homens, Dalila; Fialho, Arsénio; Lu, Timothy K; Azeredo, Joana. Designing P
  • Journal: Scientific Reports
  • Year: 2021
  • DOI: 10.1038/s41598-021-81580-2
  • Institution: Universidade Do Minho, Portugal
P. aeruginosaから単離されたバクテリオファージのゲノムから、12の偽遺伝子を取り除いてゲノムを削減した。感染効率などに差は生じたものの、抗菌性は保つ事ができた。
ウイルスぐらいのゲノムサイズなら予測で同じような事が出来たりしないだろうか。